Generazione di linee cellulari immortalizzate di medulloblastoma umano mediante espressione di una forma dominante negativa del gene TP53

La ricerca
Salsano E. – Progetto di ricerca concluso

Il medulloblastoma è il più frequente tumore cerebrale maligno dei bambini. Nonostante i progressi di chirurgia, radioterapia e chemioterapia, la letalità a 5 anni rimane del 50-70% dei casi e molti bambini, pur sopravvivendo, presentano danni a carico del sistema nervoso centrale e di altri organi a causa delle terapie effettuate.

Lo scopo del nostro progetto è quello di generare linee cellulari di medulloblastoma umano che possano essere le più fedeli possibili ai medulloblastomi da cui derivano, permettendo in tal modo di disporre di un modello utile per lo studio della patogenesi del tumore e, soprattutto, per la messa a punto di approcci terapeutici più efficaci e mirati. Ad oggi, infatti, non è facile ottenere linee cellulari di medulloblastoma a partire dal corrispondente tumore primario e le poche linee cellulari di medulloblastoma disponibili sembrano essere poco rappresentative dei tumori da cui sono derivate. Per esempio, le DAOY, una linea cellulare comunemente usata per gli studi in vitro sulla biologia del medulloblastoma e per dimostrare l’efficacia dei chemioterapici anti-medulloblastoma, presenta una delezione del gene oncosoppressore CDNK2A, una caratteristica biologica non documentata nei medulloblastomi umani.

La strategia che ci proponiamo di usare consiste nel cercare di esprimere una forma mutante del gene onco-soppressore TP53 in cellule di medulloblastoma umano ottenute dal frammento operatorio. Infatti, il TP53 è mutato nella forma più maligna e rara di medulloblastoma, il cosiddetto medulloblastoma anaplastico, e la sua mutazione potrebbe essere una condizione sufficiente per permettere l’immortalizzazione delle cellule di medulloblastoma in vitro, come abbiamo avuto modo di osservare nel nostro laboratorio.

Il progetto dovrebbe permettere di: 1) verificare se ed in che modo sia possibile introdurre ed esprimere materiale genetico in cellule tumorali di medulloblastoma umano messe in coltura; 2) verificare se mutazioni del TP53 siano sufficienti per immortalizzare tali cellule (comunemente incapaci di sopravvivere in vitro a lungo); 3) proporre una strategia nuova per generare un modello cellulare di medulloblastoma umano, da usare per studi in vitro ed in vivo, previo impianto in animali da laboratorio.

Dr. Ettore Salsano
Unità Operativa Neurologia 8-Neuro-Oncologia molecolare
Fondazione IRCCS, Istituto Neurologico Carlo Besta
Via Celoria 11, 20133 Milano, Italia
T. +39.02.2394.2285; F. +39.02.2394.2453
E mail: ettore.salsano@istituto-besta.it

Report conclusivo
Data la difficoltà tecnica di trasfettare cellule di medulloblastoma umano con una forma dominante negativa del gene TP53 in modo da garantirne un’espressione quantitativamente adeguata e stabile come proposto inizialmente, abbiamo deciso di verificare se le linee cellulari di medulloblastoma umano derivate da soggetti operati presso l’Istituto Neurologico C. Besta di Milano nel corso di due anni avessero un’alterazione molecolare a carico del gene TP53 o di un gene correlato che ne potesse compromettere il funzionamento, al pari di quanto accade in presenza di forme dominanti negative del suddetto gene. È stato possibile ottenere l’immortalizzazione di solo due linee cellulari su venti. Le due linee cellulari immortalizzate sono state chiamate MB4 ed MB16, sono state prodotte rispettivamente da un medulloblastoma classico e da un medulloblastoma anaplastico pediatrici e hanno dimostrato di continuare a replicarsi dopo 20 passaggi in condizioni serum-free (DMEM/F12 + B27 w/o vitamina A) con l’aggiunta del solo FGF2 (20ng/mL) (la presenza dell’EGF, infatti, si è dimostrata superflua). In accordo con la nostra ipotesi di lavoro, nella linea MB16 abbiamo trovato una mutazione loss-of-function in eterozigosi nel gene TP53 (IVS9+1G>T) associata ad una delezione del braccio corto del cromosoma 17 (17p) dove è ubicata l’altra copia del gene TP53; nella linea MB4, invece, è stata identificata un’amplificazione del gene MDM2, il cui prodotto è capace di inibire TP53. Da notare che la mutazione in eterozigosi del gene TP53 non è stata documentata nel DNA estratto dal frammento del corrispondente tumore di origine, suggerendo che le condizioni di coltura possano avere favorito la selezione in vitro delle sole cellule che ne erano provviste. La linea MB16 si è inoltre dimostrata tumorigenica in vivo, data la formazione di una neoplasia similmedulloblastoma dopo trapianto in topi nudi di 3 ? 105 cellule. Ancorché molto preliminari, questi dati sono a supporto dell’importanza della disregolazione del TP53 quale meccanismo chiave per le generazione di linee cellulari immortalizzate di MB umano in condizioni standard di coltura serum-free e suggeriscono che tale disregolazione può avvenire o in modo diretto come nel caso della linea MB16 o in modo indiretto come nel caso della linea MB4.
Gli sviluppi

Ettore Salsano, Rosina Paterra, Miriam Figus, Francesca Menghi, Emanuela Maderna, Bianca Pollo, Carlo Lazzaro Solero, Luca Massimi, Gaetano Finocchiaro
Expression Profile of frizzled receptors in human medulloblastomas
J Neurooncol 2011 Aug DOI 10.1007/s11060-011-0682-6.
scarica il pdf (144 KB)

Gli altri progetti