Generation of immortalized cell lines of human medulloblastoma through the expression of a dominant negative form of TP53 gene

The Research

Salsano E.

Medulloblastoma (MB) is the most frequent brain tumour in children. Despite the advances in surgery, radiotherapy and chemoterapy, mortality rate at 5 years is still 50-70% of cases and many children who survive, show damages affecting the central nervous system and other organs due to the adverse effects of the therapies.
The key aim of our project is to generate human medulloblastoma cell lines which can be as faithful as possible to the medulloblastomas they derive from, enabling in this way the creation of a useful in vitro model to study the pathogenesis of the tumour and to find more efficient and targeted therapeutic approaches. To date, obtaining medulloblastoma line cells from the correspondent primary tumour is not easy and the few medulloblastoma cell lines available seem not to be very representative of the tumours they derive from. For example, the DAOY, a cell line commonly used to investigate in vitro the biology of medulloblastomas and to prove the effectiveness of antimedulloblastoma chemiotherapic agents, shows a deletion of the oncosuppressor gene CDNK2A, a non-documented biological feature in human medulloblastomas.
To reach the aim of the project, we try to express a dominant-negative form of the oncosuppressor gene TP53 in human medulloblastoma cells obtained from surgical samples. In fact TP53 was mutated in the most malignant and rare form of medulloblastoma, the so called anaplastic medulloblastoma, and this mutation could be necessary to generate immortalized medulloblastoma cells in vitro, as we observed in our laboratory.
The project should permit to assess: 1) whether and how it is possible to introduce and express genetic material in primary human medulloblastoma cells in vitro; 2) whether TP53 mutations are able to immortalize these tumor cells (normally unable to survive in vitro for more than a few passages).
We suppose that this approach might be a novel strategy to routinely establish human medulloblastoma cell lines, useful for both in vitro and in vivo investigations (the latter after being implanted into laboratory animals).

Dr. Ettore Salsano
Unità Operativa Neurologia 8-Neuro-Oncologia molecolare
Fondazione IRCCS, Istituto Neurologico Carlo Besta
Via Celoria 11, 20133 Milano, Italia
T. +39.02.2394.2285; F. +39.02.2394.2453
E mail: ettore.salsano@istituto-besta.it

Results (in Italian)

Data la difficoltà tecnica di trasfettare cellule di medulloblastoma umano con una forma dominante negativa del gene TP53 in modo da garantirne un’espressione quantitativamente adeguata e stabile come proposto inizialmente, abbiamo deciso di verificare se le linee cellulari di medulloblastoma umano derivate da soggetti operati presso l’Istituto Neurologico C. Besta di Milano nel corso di due anni avessero un’alterazione molecolare a carico del gene TP53 o di un gene correlato che ne potesse compromettere il funzionamento, al pari di quanto accade in presenza di forme dominanti negative del suddetto gene. È stato possibile ottenere l’immortalizzazione di solo due linee cellulari su venti. Le due linee cellulari immortalizzate sono state chiamate MB4 ed MB16, sono state prodotte rispettivamente da un medulloblastoma classico e da un medulloblastoma anaplastico pediatrici e hanno dimostrato di continuare a replicarsi dopo 20 passaggi in condizioni serum-free (DMEM/F12 + B27 w/o vitamina A) con l’aggiunta del solo FGF2 (20ng/mL) (la presenza dell’EGF, infatti, si è dimostrata superflua). In accordo con la nostra ipotesi di lavoro, nella linea MB16 abbiamo trovato una mutazione loss-of-function in eterozigosi nel gene TP53 (IVS9+1G>T) associata ad una delezione del braccio corto del cromosoma 17 (17p) dove è ubicata l’altra copia del gene TP53; nella linea MB4, invece, è stata identificata un’amplificazione del gene MDM2, il cui prodotto è capace di inibire TP53. Da notare che la mutazione in eterozigosi del gene TP53 non è stata documentata nel DNA estratto dal frammento del corrispondente tumore di origine, suggerendo che le condizioni di coltura possano avere favorito la selezione in vitro delle sole cellule che ne erano provviste. La linea MB16 si è inoltre dimostrata tumorigenica in vivo, data la formazione di una neoplasia similmedulloblastoma dopo trapianto in topi nudi di 3  105 cellule. Ancorché molto preliminari, questi dati sono a supporto dell’importanza della disregolazione del TP53 quale meccanismo chiave per le generazione di linee cellulari immortalizzate di MB umano in condizioni standard di coltura serum-free e suggeriscono che tale disregolazione può avvenire o in modo diretto come nel caso della linea MB16 o in modo indiretto come nel caso della linea MB4.

Evolution

Ettore Salsano, Rosina Paterra, Miriam Figus, Francesca Menghi, Emanuela Maderna, Bianca Pollo, Carlo Lazzaro Solero, Luca Massimi, Gaetano Finocchiaro
Expression Profile of frizzled receptors in human medulloblastomas
J Neurooncol 2011 Aug DOI 10.1007/s11060-011-0682-6.
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